Pruebas serológicas en virología
Pruebas serológicas en virología
La serología es un área en la que se determina la presencia de anticuerpos en suero, aunque también, se buscan antígenos. Las pruebas serológicas aprovechan el hecho de que la mayoría de las infecciones se generan anticuerpos. Estas pruebas se usan para el diagnóstico de diversas enfermedades donde los microorganismos no se aíslan fácilmente, lo que es extremadamente útil en virología.
Principio
La clase de anticuerpo producido y las propiedades funcionales pueden aprovecharse para medir la respuesta inmune después de una infección. Las clases de anticuerpos más útiles para su determinación son los IgM e IgG. El anticuerpo que se produce inicialmente después de una infección primaria es el IgM, se vuelven detectables 1 a 2 días después del inicio de síntomas y permanecen en suero durante 6 a 12 semanas. El IgG comienza a aumentar 1 a 2 semanas después y permanece detectable por años. Por lo tanto, este ultimo se asocia con infecciones pasadas y denota protección a infecciones futuras. El anticuerpo IgM es generalmente indetectable después de 3 meses, por lo que indican una infección reciente.
Técnicas
Las técnicas serológicas pueden ser divididas en base de la complejidad de la prueba. Las más sencillas se basan en la demostración de la interacción antígeno-anticuerpo como las técnicas de precipitación y aglutinación. Las que siguen en complejidad son aquellas en las que se usan sistemas indicadores para detectar la reacción antígeno-anticuerpo como las de neutralización y fijación de complemento. Por último, las pruebas más complejas implican el uso de un segundo sistema de anticuerpos marcados, como los ensayos inmunoenzimáticos de ELISA.
- Precipitación
Una de las técnicas basadas en este principio es el método de doble difusión de Ouchterlony y se puede utilizar para detectar anticuerpos o antígenos. En el primer caso se emplea un anticuerpo con especificidad conocida y en el segundo un antígeno conocido. La técnica se basa en la difusión del antígeno y el anticuerpo uno hacia el otro en un gel de agarosa y la aparición de una línea de precipitación blanca indica una reacción positiva. Otra técnica basada en este principio es la contrainmunoelectroforesis que dirige específicamente el movimiento del antígeno y el anticuerpo uno hacia el otro en un campo eléctrico. Sin embargo, estas técnicas han sido sustituidas por métodos más sensibles.
- Hemaglutinación e inhibición de la hemaglutinación
Las técnicas de hemaglutinación aprovechan la hemaglutinina que poseen ciertos virus como el de la gripe, rubéola y sarampión que aglutinan eritrocitos de especies seleccionadas. Esta técnica se usa principalmente para el virus de la gripe, los de tipo A y B aglutinan glóbulos rojos humanos del grupo O, de cobayo y de aves a 4°C y 20°C, mientras que el de tipo C solo aglutina eritrocitos de ave. Por otro lado, la técnica de inhibición de la hemaglutinación aprovecha la presencia de hemaglutinina para detectar anticuerpos en suero. Ya que la presencia de anticuerpos específicos se combina con la hemaglutinina inhibiendo la hemaglutinación. Estas técnicas se emplean para los virus gripales, pero para otros como el de la rubéola se ocupan otros ensayos más sensibles.
- Técnicas de aglutinación de partículas
Existen varias técnicas basadas en la aglutinación de partículas como látex. Estas se realizan en portaobjetos, cartón o en pocillos de microtitulación.
Aglutinación en látex
Las partículas de látex de poliestireno se sensibilizan o recubren con antígenos virales y ante la presencia de anticuerpos específicos en suero se aglutinan. Una prueba positiva se considera cuando se observa una aglutinación de las partículas de látex. Estas pruebas son ampliamente usadas dada su sencillez y facilidad de uso.
Aglutinación de partículas de carbón
Este método lo emplea la prueba de VDRL, que en este caso los antígenos recubren a partículas de carbón. La lectura se mejora usando un fondo blanco.
- Fijación de complemento
En esta técnica el suero del paciente se inactiva a 56°C durante 30 minutos, esto para destruir el complemento de este mismo. Posteriormente se agrega el antígeno viral y complemento de conejo. Si en el suero existen anticuerpos específicos contra el antígeno añadido ocurrirá una reacción antígeno anticuerpos y el complemento que se añadió se fija a esta interacción. Después se añade un sistema detector de antígenos y anticuerpos en forma de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos de conejo. Si el complemento ha sido “fijado” en la primer reacción, los eritrocitos de oveja no se lisan lo que indica una reacción positiva e indica la presencia de anticuerpos en el suero. Una reacción negativa se presenta cuando el complemento no fue fijado o capturado por ausencia de anticuerpos contra el antígeno, es así que se une a los eritrocitos sensibilizados y los lisa. Es una prueba cuantitativa ya que el suero se diluye en serie para evaluar los niveles de anticuerpos presentes.
- Neutralización
La interacción de anticuerpos específicos contra el virus neutraliza el proceso infeccioso e impide la infección. Se ocupan sistemas in vivo como cultivos celulares o animales vivos para evaluar la neutralización del virus. Por esta razón, estas técnicas han dejado de emplearse.
- Pruebas inmunoenzimáticas
Este tipo de técnicas serológicas son las más utilizadas en la actualidad. Existen muchas variaciones metodológicas, pero todas se basan en el siguiente principio: se fija un antígeno a una fase solida (placa de microtitulación o perla de poliestireno o polivinilo). Posteriormente se añade suero del paciente y se incuba un determinado tiempo para que ocurra la reacción antígeno-anticuerpo, después del tiempo de incubación, se hacen lavados para eliminar el suero excedente. Pasados los lavados, se añado un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana el cual se encuentra marcado por una enzima (anticuerpo conjugado). Por último, se agrega el sustrato de la enzima y si la reacción Ag-Ac ocurrió, claramente el Ac anti-inmunoglobulina humana se pegó al complejo reaccionando con el sustrato y generando un color. Si no ocurrió la reacción Ag-Ac, el anticuerpo conjugado no se une y al agregar el sustrato no ocurrirá la reacción.
Existen otras técnicas que tienen principios similares pero que el anticuerpo anti-inmunoglobulina humana se conjuga con una molécula fluorescente o radioisótopos.
